Raziskovalni projekti

Vsebinski opis projekta

Vsesplošno je znano, da bakterije v biofilmih predstavljajo resno grožnjo človeštvu. Pri tem vse več raziskav kaže, da so zunajcelične polimerne snovi (EPS) tista komponenta biofilma, ki celice v biofilmih odločilno ščiti tako pred mehanskimi napadi kot tudi napadi s protimikrobnimi snovmi. Zato je ključno, da razumemo kako različne komponente EPS in njihova strukturiranost prispevajo   k protibiofilmski odpornosti. V zadnjem desetletju je sintetična biologija dosegla hiter napredek, kljub temu pa je bilo na področju raziskav biofilmov bore malo inženirstva. Naš predlog je, da kot prvi ustvarimo umetne biofilme, sestavljene iz več naravnih eksopolimernih spojin (EPS), kjer bomo lahko kontrolirano spreminjali EPS sestavo in s tem ugotavljali njeno povezanost tako z mehansko kot biocidno odpornostjo. Velika raznolikost bakterijskega EPS vključuje β-fruktan polisaharid levan, amiloidni protein TasA, polianion y-poliglutaminska kislina in eDNA. Vse te komponente želimo izolirati in strukturno okarakterizirati. Z mešanjem teh zares različnih polimerov bomo lahko zgradili umetne biofilme s prilagojenimi mehanskimi in difuzibilnimi lastnostmi, ki bodo tvorili raziskovalno platformo, ki trenutno ne obstaja. Sintetični biofilmi z EPS različne sestave bodo vsebovali celice divjega tipa. ​​Tako bomo naredili umetne mikrobiofilme z določeno prostorsko porazdelitvijo. Tako sestavljene sintetične biofilme bomo izpostavili mehanskemu stresu in delovanju protimikrobnih snovi, kar predstavlja trenutne strategije za izkoreninjenje biofilmov. Najpomembnejše mehanske lastnosti gelskih struktur, kot je biofilm, so viskoelastični parametri, ki določajo strukturni odziv na zunanjo strižno silo, kar lahko merimo z rotacijsko in mikro reologijo. Viskoelastični parametri so tesno povezani s poroznostjo in difuzijskimi lastnostmi biofilma, kar vpliva na penetracijo antimikrobnih sredstev. Trenutno nimamo jasne slike o tem, kako različne komponente EPS vplivajo na mehanske in difuzijske lastnosti biofilmov in kako je to povezano z  učinkovitostjo protibiofilmskih pristopov. Zato naši novo oblikovani sintetični biofilmi z nadzorovanimi mehanskimi in difuzijskimi lastnostmi nudijo edinstveno priložnost za izboljšanje našega razumevanja odpornih, zdravju škodljivih in korozivnih biofilmov. Znanje o šibkih točkah v strukturi biofilma nam bo omogočilo tudi nasprotno- formiranje super odpornih biofilmov. Sestavili jih bomo iz odpornega EPS in pred izbranih odpornih celic. Tako pripravljene biofilmske trdnjave so idealne za testiranje novih protimikrobnih sredstev.

Super odporni biofilmi, izdelani po meri, bodo izpostavljeni delovanju konvencionalnih in novih protimikrobnih sredstev - fitokanabinoidov in inhibitorjev DNA giraze, ki so bili nedavno odkriti in se lahko kemično modificirajo, da bi povečali uničenje biofilma. S konfokalno lasersko skenirno mikroskopijo in diferencialnim barvanjem bomo opazovali viabilnost posameznih celic in njihov položaj v biofilmu. Z uporabo fluorescenčnih tehnik (FRAP) bomo določili biofilmske difuzijske lastnosti. Na podlagi analize zbranih podatkov bomo lahko najverjetneje zagotovili nove protimikrobne snovi in ​​spoznanja za razrešitev dileme dramatične protimikrobne odpornosti v biofilmih. Predvidevamo, da bomo lahko zagotovili bistvene smernice za racionalno načrtovanje boljših protimikrobnih zdravil.

Sestava projektne skupine

• Iztok Dogša
• Katja Molan
• Andi Erega
• Katarina Šimunovič
• Barbara Kraigher
• Ines Mandič Mulec
• David Stopar
• Nace Zidar
• Štefan Možina

Faze projekta in njihova realizacija

(DP1): Izolacija EPS component, njihova fizikalno-kemijska karakterizacija, izdelava sintetičnih biofilmov, v teku

(DP2): sintetični biofilmi v mikrofluidnih napravah, v teku

(DP3): testiranje biofilmov na mehanski stres

(DP4): identifikacija šibkih točk v odpornosti biofilmov

(DP5): izdelava super-odpornih biofilmov in izboljšane protimikrobne učinkovine 

Partnerji v projektu

• UL Fakulteta za farmacijo