Agronomija

OPIS PROJEKTA

Intenzivno kmetijstvo in svetovni trg predstavljata veliko tveganje za hitro širjenje rastlinskih bolezni, kar lahko povzroči velike gospodarske izgube ter vodi v lakoto in svetovno krizo. Med različnimi rastlinskimi patogeni so viroidi najmanjši in najpreprostejši; kljub temu pa lahko povzročijo hude in neozdravljive bolezni, ki jih ni mogoče nadzorovati z uporabo fitofarmacevtskih sredstev, njihov vpliv na dovzetnega gostitelja pa je lahko uničujoč. Odkritje viroida razpokanosti skorje agrumov (CBCVd) na hmelju v Sloveniji je nedavni primer hudega prenosa viroidov na novega občutljivega gostitelja in širjenja na nova območja. To kaže, kako nujna je hitra, občutljiva in selektivna terenska detekcija za učinkovito obvladovanje viroidnih bolezni.

Elektrokemija ponuja atraktivne lastnosti, kot so dobra občutljivost, selektivnost, poceni in prenosni instrumenti ter skoraj neomejene možnosti za modifikacije elektrodne površine, katerih namen je dizajniranje zmogljivih elektrokemijskih (bio)senzorjev. Elektrokemijske metode so se izkazale tudi kot učinkovito orodje za preprosto in občutljivo analizo nukleinskih kislin (NAs). Poleg uporabe različnih protokolov za ojačitev signala in označevanje, pa karakteristična elektrokemijska aktivnost nukleobaz omogoča tudi zaznavanje NAs brez označevalcev.

V tem projektu bomo, v sodelovanju s češkim partnerjem iz IBP, razvili elektrokemijske NA biosenzorje (genosenzorje) za občutljivo in selektivno terensko zaznavanje viroida razpokanosti skorje agrumov (CBCVd). Genosenzor za detekcijo viroidne RNA (ali cDNA kot produkta reverzne transkripcije) bo temeljil na izbranih osnovnih tiskanih elektrodah, površinsko modificiranih s senzorskimi prevlekami, ki bodo omogočale učinkovito imobilizacijo bioloških prepoznavnih elementov, ustrezno občutljivost, selektivnost in robustnost. Izbira, (pred)obdelava in modifikacija površine osnovnih elektrod ter izbira senzorske membrane bo odvisna od detekcijskega protokola. Preučevali bomo različne elektrodne materiale in jih kombinirali s strategijami za detekcijo viroida, kot so:

(a) hibridizacija CBCVd RNA/cDNA z neoznačeno lovilno sondo;

(b) hibridizacija CBCVd RNA/cDNA z lovilno sondo, označeno z redoks sistemom ali encimom;

(c) zaznavanje redukcije vodika kot funkcijo hibridizacijskega dogodka, v prisotnosti katalizatorjev;

(d) označevanje sond z izbranimi kovinskimi nanodelci, ki omogočajo občutljivo detekcijo s pomočjo stripping voltametrije.

Posebno pozornost bomo namenili strategijam, ki vključujejo vgradnjo označenih nukleotidov z DNA polimerazami. Raziskali in izbrali bomo označene deoksinukleozidne trifosfate in DNA polimeraze skupaj z optimizacijo ustreznih protokolov za:

(i) vključitev označevalcev v viroidno cDNA med reverzno transkripcijo;

(ii) pomnoževanje označene cDNA s PCR in še posebej z izotermnim pomnoževalnim protokolom, kot je LAMP, in

(iii) označevanje končnega dela RNA ali DNA verige brez matrice.

Raziskave bodo osredotočene na tehnike biokatalitskega (encimskega) ali elektrokatalitskega ojačevanja signala in na razvoj preprostih detekcijskih pristopov, ki temeljijo na prednostni adsorpciji označene/pomnožene ciljne cDNA na elektrodo neposredno iz reakcijske zmesi.

Nazadnje bomo elektrokemijski genosenzor sklopili s prenosnim, v tem projektu razvitim in optimiziranim protokolom pomnoževanja NAs, kot je RT-LAMP, v kombinaciji z označevanjem NAs, kar bo znatno izboljšalo občutljivost in selektivnost genosenzorja. S tehnologijo 3D tiskanja bomo izdelali primeren in prenosen grelni sestav za korak izotermnega pomnoževanja.

Razvito genosenzorsko platformo za zgodnjo detekcijo viroida CBCVd bomo preizkusili in validirali na terenu v realnem vzorcu hmelja. 

FAZE PROJEKTA IN REALIZACIJA

DS 1. IZBIRA OSNOVNIH ELEKTROD IN NJIHOVA (PRED)OBDELAVA

DS 2. MODIFIKACIJA ELEKTRODNE POVRŠINE Z LOVILNO SONDO

DS 3. IZBOLJŠANJE OBČUTLJIVOSTI IN SELEKTIVNOSTI

DS 4. SKLOPITEV IZOTERMNEGA POMNOŽEVANJA Z GENOSENZORJEM

DS 5. PRILAGODITEV ZA TERENSKO DETEKCIJO IN VALIDACIJA